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扩增和测序流程

发布者:    发布时间:2013.01    附件下载

  1. PCR扩增
  聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是快速扩增DNA序列最常用的方法。首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性→复性→延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
  ITS2片段扩增正向引物ITS2F:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′;反向引物ITS3R:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH片段扩增正向引物:5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′;反向引物:5′-CGCGCATGGTG-GATTCACAATCC-3′。COI序列扩增正向引物HCO2198:5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′;反向引物LCO1490:5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。PCR反应体系以25 μL为参照,反应体系为:PCR Buffer(10×)2.5 μL,MgCl2 2 μL(25 mmol/L),dNTPs混合物2 μL(2.5 mmol/L),上游和下游引物各1.0 μL(2.5 μmol/L),模板DNA,Taq DNA聚合酶1.0 U,加无菌双蒸水至25 μL,也可根据具体情况加以调整。应设置未加模板DNA的阴性对照。ITS2序列扩增程序:94℃,变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s,40个循环;72℃延伸10 min。psbA-trnH序列扩增程序:94℃变性5 min;94℃变性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,30个循环;72℃延伸7 min。COI序列扩增程序:94℃ 1 min;94℃ 1 min,45℃ 1.5 min,72℃ 1.5 min,5个循环;94℃ 1 min,50℃ 1.5 min,72℃ 1 min,35个循环;72℃ 5 min。其他DNA条形码序列PCR扩增引物应参考相关研究结果。
  模板DNA浓度也是影响PCR扩增效果的一个重要因素。在最初扩增时需根据具体样品,设计模板浓度梯度,考察模板适宜浓度,以获得理想的扩增条带。
  采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后,阴性对照应无条带,目的产物如条带单一,可直接测序;如有多条带或出现拖尾现象,则需在紫外光下快速有效地切下所需片段所在位置的凝胶,然后再选用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收,回收后的产物还要进一步经琼脂糖凝胶电泳检测后,测序。
  2. 序列测定
  测序原理同Sanger测序法,PCR扩增引物作为测序引物,使用DNA序列测序仪进行双向测序,目前各地均有专业的测序服务公司进行DNA测序服务。
 

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